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诺如病毒(NV)荧光定量RT-PCR试剂盒(探针法)图片
产品货号:
BTN15-24800
中文名称:
诺如病毒(NV)荧光定量RT-PCR试剂盒(探针法)
英文名称:
Norwalk Viruses RT-qPCR Kit(Probe Method)
产品规格:
50次
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本产品以探针法荧光定量RT-PCR技术为基础开发的专门检测诺如病毒的通用试剂盒。


诺如病毒(Norwalk Viruses,NV)是一组形态相似、抗原性略有不同的RNA病毒。诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行,全年均可发生感染,感染对象主要是成人和学龄儿童,寒冷季节呈现高发。美国每年在所有的非细菌性腹泻暴发中,60~90%是由诺如病毒引起。荷兰、英国、日本澳大利亚等发达国家也都有类似结果。在中国5岁以下腹泻儿童中,诺如病毒检出率为15%左右,血清抗体水平调查表明中国人群中诺如病毒的感染亦十分普遍。诺如病毒感染性腹泻属于自限性疾病,没有疫苗和特效药物,因此灵敏快捷的诊断产品具有重要的意义。


  1. 即开即用,用户只需要提供样品RNA模板。
  2. 引物和探针经过优化,灵敏性高。
  3. 提供阳性对照,便于区分假阴性样品。
  4. 特异性高,引物是根据诺如病毒高度保守区设计,不会跟其他病毒的RNA发生交叉反应。
  5. 可以检测可以感染人的1、2、4型诺如病毒。
  6. 本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量RT-PCR反应。
  7. 本产品只能用于科研。



组分规格
探针法qRT-PCR缓冲液500μL
探针法qRT-PCR酶混合液100μL
荧光PCR专用模板稀释液1mL
诺如病毒通用探针法qRT-PCR引物-探针混合液150μL
诺如病毒通用探针法qRT-PCR阳性对照(1×107拷贝/μL)50μL

保存:-20℃,有效期一年。



一、稀释PCR阳性对照(以101~106拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)
由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
  1. 标记6个离心管,分别为6,5,4,3,2,1。
  2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液(最好用带芯枪头,下同)。
  3. 在6号管中加入5μL1×107拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡1分钟,得1×
    10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
  4. 换枪头,在5号管中加入5μL1×106拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×105拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
  5. 换枪头,在4号管中加入5μL1×105拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×104拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
  6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上用。


二、样品RNA的制备
  1. 如果有N个样品,最好设置N+2个提取,多出的一个是样品制备PC(样品制备阳性对照),一个是样品制备NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为PC。另外用水作为NC。
  2. 用自选方法纯化样品的RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。


三、Probe qRT-PCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)
  1. 如果做定量分析并且只做1次重复,则标记N+9个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照(用水做模板),6个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做1次重复,则标记N+4个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照(用水做模板),1个用于PCR阳性对照(用第4号管中的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为描述操作步骤,
  2. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加):
    成分样品管
    N+2个
    PCR阴性
    对照管
    PCR阳性对照管
    (1~6管)
    探针法qRT-PCR缓冲液10μL10μL各10μL
    探针法qRT-PCR酶混合液2μL2μL各2μL
    诺如病毒通用探针法qRT-PCR引物-探针混合液3μL3μL各3μL
    N=2个待测样品RNA模板5μL--
    超纯水-5μL-
    第7步所得标准曲线样品稀释液(1~6号)--各5μL


  3. 盖上盖子后上机,按下面参数进行qRT-PCR:
    过程温度时间
    逆转录55℃15min
    预变性95℃5min
    PCR反应
    (50个循环)
    95℃15sec
    55℃1min(采集FAM通道的荧光信号)
    72℃1min


四、数据处理
  1. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的log值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值,再推算出其浓度。
  2. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照Ct必须大于或等于45。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于40。对待测样品,如果其Ct大于或等于45则为阴性,如果小于或等于40则为阳性。如果在40~45之间,则重复一次。
    重复实验的Ct值如果大于或等于45则为阴性,反之则为阳性。




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